實(shí)驗一：肝素 (Heparin)

中南大學(xué)湘雅三醫院呂奔教授團隊圍繞膿毒癥的發(fā)病機理及靶向干預開(kāi)展了系列研究，揭示了膿毒癥重要的致病機制，為膿毒癥的診治提供了潛在的生物標志物和藥物干預靶點(diǎn)，并針對該靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選，為今后膿毒癥的防治提供了新的思路。

2021年，呂奔教授研究團隊在Immunity雜志上發(fā)表文章，針對前序研究中發(fā)現的HMGB1-LPS-caspase-11途徑，篩選出肝素 (Heparin) 能高效并選擇性地抑制Caspase-11活化，并闡明了肝素在膿毒癥中能通過(guò)抑制Caspase-11的活化防止臟器損傷、DIC發(fā)生和死亡的機制。

觀(guān)察圖1的動(dòng)力學(xué)表征數據可知，肝素與HMGB1有較強結合，Kd=5.59*10^^-6 M。同時(shí)，通過(guò)多濃度梯度進(jìn)樣的實(shí)驗設計，可以看出LPS+Heparin實(shí)驗組相較LPS對照組，與包被有HMGB1蛋白的芯片的響應值 (Response, RU) 顯著(zhù)降低，即可看出Heparin可以抑制LPS與HMGB1的識別/結合。

實(shí)驗二：Tuftsin

北京大學(xué)王月丹與初明教授團隊圍繞著(zhù)新冠病毒的防治工作篩選到了一種天然產(chǎn)物Tuftsin，相關(guān)成果也于2022年發(fā)表在Frontiers in Molecular Biosciences雜志上。Tuftsin是機體脾臟產(chǎn)生的一段生理活性肽，其基本功能是刺激巨噬細胞和粒細胞，提高促吞噬的能力；可以通過(guò)增強效應細胞的細胞毒功能殺傷腫瘤細胞等，在抗感染方面具有不能替代的作用。

通過(guò)多輪的化藥庫篩選、分子對接等實(shí)驗，課題組篩選到Tuftsin分子。隨后，使用Biacore體外驗證了其與ACE2分子及抑制的效應分子NRP1的親和力，結果表明Tuftsin能特異性識別并結合ACE2分子。

此外，研究人員通過(guò)多濃度梯度進(jìn)樣的實(shí)驗設計，將S1蛋白固定在CM5芯片上，設置ACE2 (5 nM) 對照組及Tuftsin+ACE2（ACE2為固定濃度，5 nM; Tuftsin設置9/156/625 nM）實(shí)驗組；結果表明，Tuftsin濃度越高，結合響應值 (Response, RU) 越低，即證明Tuftsin可有效阻斷/抑制S1與ACE2的識別與結合。

實(shí)驗三：黃連素 (Berberine，BBR) 

首都醫科大學(xué)和北京中醫藥大學(xué)的科研團隊在傳統中藥中篩選特異性抑制凝血酶的小分子抑制劑，最終得到的黃連素 (Berberine，BBR) 被證明可以直接結合凝血酶從而抑制其誘導的血小板聚集。凝血酶 (Thrombin) 是血液凝固級聯(lián)反應中的關(guān)鍵酶，被認為是多種心血管疾病中重要的藥物靶點(diǎn)。

研究人員首先在Biacore上證明了Berberine可以直接與凝血酶結合，兩者的親和力為16.39 μM（圖3 A/B），比已上市的抗凝血藥阿加曲班 (Argatroban) 的親和力更高（圖3 C/D，KD=53.78 μM）。

同時(shí)，研究人員利用Biacore的A-B-A進(jìn)樣設計競爭實(shí)驗，證明Berberine與Argatroban結合在Thrombin相同的位點(diǎn)上。A-B-A的進(jìn)樣方式簡(jiǎn)化了競爭實(shí)驗的設置，允許兩種不同的溶液按照溶液A/溶液B/溶液A的順序在同一個(gè)循環(huán)內進(jìn)樣，由于競爭樣品無(wú)需再溶解在運行緩沖液里，大大減少了競爭樣品的消耗量，非常適用于藥物的競爭分析（圖4）。

從圖5的實(shí)驗結果中可以看到：Berberine不存在時(shí)，Argatroban與Thrombin有明顯的結合信號（圖5，red line）；而在300 μM Berberine存在的情況下（A-B-A樣品設置參照圖4），Argatroban與Thrombin的結合響應值明顯降低（圖5，blue line）。證明Berberine在Thrombin上的結合位點(diǎn)與Argatroban是一樣的。綜合后續的血小板凝集實(shí)驗，這一研究說(shuō)明Berberine是潛在的安全有效的凝血酶抑制藥物。

實(shí)驗一：紫草素 (SHK)

NF-κB是一個(gè)可誘導轉錄因子家族，調節多種生理及病理進(jìn)程。NEMO/IKKβ復合物則是NF-κB信號通路中的中心調節劑。2022年，大連醫科大學(xué)馬驍馳、中國科學(xué)院上海藥物研究所果德安、中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所葉明亮課題組在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志上發(fā)表了相關(guān)成果，篩選到NEMO/IKKβ復合物的潛在抑制劑-紫草素 (SHK) 。

為測得SHK抑制NEMO/IKKβ復合物的IC₅₀，課題組做了相關(guān)實(shí)驗：把MBP-IKKβ蛋白固定在CM5芯片上，再將GST-NEMO+SHK（GST-NEMO為固定濃度，1 μM; SHK設置0~3125 nM）的預混液以多濃度梯度進(jìn)樣的形式流過(guò)芯片表面，進(jìn)行結合信號的采集，擬合作圖，測出IC₅₀。

同時(shí)，課題組考慮到實(shí)驗的嚴謹性，將GST-NEMO作為固定相進(jìn)行了實(shí)驗重復。課題組使用Biacore測得了紫草素抑制NEMO/IKKβ復合物的IC₅₀為174 nM，證明其可在體內外抑制NF-κB通路，從而減緩結直腸癌細胞的增殖，為開(kāi)發(fā)有效的小分子PPI抑制劑提供一些新的思路。

倫斯勒理工學(xué)院、中國農業(yè)大學(xué)等單位圍繞著(zhù)綠茶中的抗氧化劑EGCG展開(kāi)了豐富的研究，并于2021在NATURE COMMUNICATIONS雜志上發(fā)表相關(guān)成果。文章中闡釋EGCG可與p53分子結合并阻斷p53與MDM2分子（E3泛素連接酶）的結合，從而抑制MDM2對p53的泛素化、穩定了p53的抗腫瘤活性。

課題組首先使用Biacore測定了EGCG與全長(cháng)p53、NTD-p53的親和力，探明了EGCG與p53的識別作用靶點(diǎn)位于p53分子的N末端。同時(shí)，課題組將MDM2分子固定在CM5芯片上，探究了MDM2分子與p53的親和力KD=0.6±0.1 μM。接著(zhù)使用同一張芯片展開(kāi)了IC₅₀測試：將p53+EGCG（p53為固定濃度，250 nM; EGCG設置0~500 nM）的預混液以多濃度梯度進(jìn)樣的形式流過(guò)芯片表面，進(jìn)行結合信號的采集，擬合作圖，測出IC₅₀=0.2 μM。

小結