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      技術(shù)干貨:一文讀懂菌液OD600測量

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          微生物和細胞生長(cháng)的光密度(OD)測量是微生物學(xué)及生物發(fā)酵實(shí)驗室中最常用的方法之一,用于在進(jìn)行蛋白表達或監測培養過(guò)程時(shí)確定收獲的最佳時(shí)間。細胞、細菌或酵母在液體培養基中的生長(cháng)情況(細胞密度、細菌生長(cháng)、酵母生長(cháng))通常通過(guò)測量600nm下的光密度(OD600)來(lái)獲得。OD600測量通常用于確定細菌培養物的生長(cháng)階段,這些測量有助于確保在適當的細胞密度下收獲細胞。

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          由于OD600測量的光密度是由光散射而非光吸收引起的,因此細胞的大小和形狀以及死細胞和碎片可能會(huì )增加光散射。因此,當在相同的儀器上測量時(shí),處于相同密度水平(如Cells/mL)的不同細胞類(lèi)型可能顯示出不同的OD600值。

          細菌細胞的生長(cháng)通常經(jīng)歷一系列連續的階段,包括滯后、對數、靜止和衰退。通常,應在對數期結束時(shí)收獲細胞,使用樣品的光密度OD600來(lái)確定何時(shí)達到這一時(shí)間點(diǎn),是非常便捷的。在誘導或收獲之前,細胞通常常規生長(cháng)至OD600達到約0.4。

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      朗伯-比爾定律與OD600


          朗伯-比爾定律,根據經(jīng)驗將光的吸收與樣品的濃度聯(lián)系起來(lái)。該定律表明,光通過(guò)特定樣品的透射率(T=I/Io,其中I=出射光,Io=入射光)、特定化合物的消光系數(ε)、樣品中具有光吸收的物質(zhì)的濃度(c)和光傳播的距離(d)之間存在對數關(guān)系。根據朗伯-比爾特定律,OD值與細菌濃度(C)或數量(N)具有類(lèi)似的定義。然而,OD600的測量實(shí)際上是濁度的測量,因此,我們可以應用朗伯-比爾定律定律,但需要進(jìn)行一些額外的考量,如樣品濁度(濃度)的適用范圍,設備收集非散射光的結構等。


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      OD600讀數的差異


          對于混濁的樣品,如細胞培養物,測量的吸光度的主要來(lái)源于光散射,而不是完全遵循朗伯-比爾定律中的分子吸收的原理。因此,測量取決于分光光度計的光學(xué)設置(比色皿和儀器出射狹縫狹縫之間的距離、單色器的性能、狹縫幾何形狀等),不同的儀器類(lèi)型很可能會(huì )為相同的混濁樣品提供不同的OD 600讀數。因此,如果要比較不同分光光度計的結果,則必須首先使用兩種不同儀器上的相同樣本進(jìn)行OD600值比較,并進(jìn)行相關(guān)性的歸一化。


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      OD600校正值公式


          NanoPhotometer?或OD600 DiluPhotometer?等儀器默認“校正系數”為1,如使用相應方法進(jìn)行調整,將有助于在不同設備之間提供可比較的結果。


      OD600校正因子= 設備1測量值 / 設備2測量值


          或者使用創(chuàng )建適當的校準曲線(xiàn)來(lái)采用更精確的方法,可以通過(guò)在不同濃度范圍內比較測量的OD600與預期的OD600來(lái)構建校準曲線(xiàn)。預期的OD600是通過(guò)使用替代技術(shù)(例如顯微鏡載玻片法)進(jìn)行細胞計數,并使用經(jīng)驗法則將1個(gè)OD600=5×108個(gè)cells/ml的大腸桿菌聯(lián)系起來(lái)。


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          通常建議使用試管或比色皿進(jìn)行OD600測量,以確保讀數的穩定性,較大體積樣品提供了更大的濁度平均值,誤差相對較小。此外,為了防止菌體沉降過(guò)快,并給出隨時(shí)間變化的OD讀數,可向樣品中添加甘油。對于一些很小的樣品量要求,使用微滴進(jìn)行測量,也是可行的,特別是NanoPhotometer?的樣品壓縮法,在液膜中測量,可避免液柱中顯著(zhù)的沉降現象。但需注意在上樣前樣品的充分混勻。

       

          用于測量的儀器的線(xiàn)性范圍對于覆蓋培養物的整個(gè)生長(cháng)周期至關(guān)重要,建議至少2.5 OD的OD限值以提供足夠的工作范圍。如果存在大量的死細胞,使結果模糊不清,則樣本可能在整個(gè)范圍內不是線(xiàn)性的。如果樣品仍然超出范圍,則可能需要稀釋?zhuān)粦屑氝x擇參數以覆蓋整個(gè)所需區域,而不影響測量的線(xiàn)性度。


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          為了減少OD600測量所需的體積,并避免耗時(shí)且容易出錯的手動(dòng)稀釋?zhuān)梢允褂锰厥獾谋壬?。Implen的DiluCell?自動(dòng)稀釋比色皿可降低樣品體積要求,并提供自動(dòng)虛擬樣品稀釋。由于DiluCell?的獨特設計,光路從標準的10毫米減少到1毫米(DC 10)。根據朗伯-比爾定律,光程因子為10。使用DiluCell?自動(dòng)稀釋可節省時(shí)間,并排除稀釋誤差和交叉污染。


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          德國Implen提供多種OD600測量解決方案,包括應用于基礎測量和高級工藝開(kāi)發(fā)的不同機型,具有可靠的測量結果和豐富的軟件功能,以及合規性功能,能夠充分滿(mǎn)足不同用戶(hù)的需求。OD600測量,認準德國Implen。


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