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外泌體是一類(lèi)細胞產(chǎn)生的細胞外囊泡 (EVs) ，直徑約40~160 nm，它們攜帶核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝物，是細胞間的通訊介質(zhì)，影響細胞生物學(xué)的各個(gè)方面。人體幾乎所有類(lèi)型的細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，外泌體廣泛分布在如血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等。
由于外泌體等EVs具有高生物利用度、生物穩定性、靶向特異性、低毒性和低免疫原性，其在疾病診斷、治療及藥物遞送中潛力。Biacore作為分子互作“金標準”，研究EVs當然也離不開(kāi)ta。
免疫檢查點(diǎn)療法通過(guò)調節T細胞中的免疫檢查點(diǎn)信號通路來(lái)增強抗癌免疫應答，取得了重要的臨床進(jìn)展，然而由于免疫衰竭，超過(guò)一半的癌癥患者對這種治療沒(méi)有反應。北京大學(xué)呂萬(wàn)良教授團隊針對腫瘤免疫檢查點(diǎn)治療中免疫衰竭與免疫逃逸的問(wèn)題，重組構建了一種基因工程外泌體PD1 - Imi Exo，用于逆轉腫瘤免疫治療中的T細胞衰竭。相關(guān)研究于今年初在線(xiàn)發(fā)表在Bioactive Materials雜志[2]。
圖1：工程化外泌體PD1 - Imi Exo研究路線(xiàn)及作用機制
PD1- Imi Exo通過(guò)基因工程設計PD1，同時(shí)包裹一種免疫佐劑Imiquimod，可以首先阻斷CD8+ T細胞與腫瘤細胞的結合，表現出PD1/PDL1免疫檢查點(diǎn)阻斷作用，并通過(guò)釋放Imiquimod促進(jìn)未成熟樹(shù)突狀細胞成熟，激活和恢復CD8+ T細胞的功能，逆轉免疫衰竭（圖1）。 為了驗證PD1 Exo與PDL1的直接結合，作者使用Biacore分別測定了PDL1與PD1蛋白及與PD1 Exo的結合（圖2）。作者首先將PDL1蛋白偶聯(lián)在CM5芯片上，PD1蛋白或PD1 Exo作為分析物，測定結合變化。結果表明，相較于PD1蛋白，PD1 Exo與PDL1的親和力提高了數百倍。而除了親和力信息外，Biacore實(shí)時(shí)檢測的特點(diǎn)可以獲得二者的結合速率和解離速率信息，相較于PD1蛋白，PD1 Exo與PDL1的解離明顯變慢，說(shuō)明其與PDL1的結合更加穩定，預示著(zhù)其可能具有較長(cháng)的藥效。
圖2：Biacore檢測PDL1與PD1蛋白 (G) 與PD1 Exo (H) 的結合
文中實(shí)驗還表明，PD1 - Imi Exo呈水泡狀圓形（約139 nm），對腫瘤細胞和樹(shù)突狀細胞均有明顯的靶向作用和較強的結合作用，對黑色素瘤小鼠和乳腺癌小鼠均有顯著(zhù)的治療效果。本研究也為提高PD1/PDL1的治療效果，通過(guò)重建患者的免疫功能來(lái)預防術(shù)后腫瘤復發(fā)或轉移，從而鞏固整體預后提供了一種有希望的新策略。
除了通過(guò)基因工程化改造外，胞外對已分離的細胞外囊泡 (EV) 表面進(jìn)行工程化改造的方法不受細胞活性影響，還可以引入非天然的分子。意大利布雷西亞大學(xué)的研究團隊2023年在Nanoscale Advances發(fā)表的封面文章中，分別利用物理吸附與化學(xué)吸附（利用點(diǎn)擊化學(xué)共價(jià)結合）兩種方法將Cetuximab (CTX) 修飾在Red blood cell EV表面，并使用Biacore檢測兩種方法制備的REV與靶點(diǎn)EGFR結合的差異[3]。
圖3：抗體EV組裝方法示意圖
作者使用Biacore X100，將EGFR偶聯(lián)在CM5芯片上，分別檢測了EGFR與EGF、CTX、mCTX (modfied CTX) 、天然REVs、四種工程化REVs的親和力。EGF、CTX與EGFR的親和力均與文獻報道相符 (67.3nM、1.8nM) ，而化學(xué)修飾則使CTX的親和力降低，mCTX親和力為3.6nM。在檢測EGFR與外泌體的結合時(shí)，首先天然的REVs未觀(guān)察到結合信號，化學(xué)吸附的REVs-click-mCTX的親和力為0.17nM，高于mCTX十倍，且呈現典型的慢解離過(guò)程，物理吸附的外泌體REVs-physi-mCTX親和力與REVs-click-mCTX相當。
圖4：Biacore X100檢測EGFR與蛋白或REVs的親和力
此外，作者還發(fā)現，同一張EGFR芯片檢測中，REVs-click-mCTX的飽和結合信號Rmax比REVs-physi-mCTX高4倍，推測可能時(shí)由于物理吸附較弱，當mCTX與芯片表面的EGFR結合更強時(shí)，mCTX從REVs上脫落下來(lái)，牢牢地結合在芯片表面地EGFR上，并與REVs-physi-mCTX競爭性結合EGFR，最終導致芯片表面的最大結合量Rmax降低。而工程化的REVs-mCTX穩定性可能對體外囊泡攝取及其實(shí)際治療應用具有重要意義，細胞實(shí)驗發(fā)現REVs-click-mCTX對靶細胞表現出更好的結合和攝取能力。
外泌體廣泛分布在血液與體液等液態(tài)標本中，通過(guò)檢測其內容物或表面生物標志物等，可以進(jìn)行精準的疾病診斷。錫耶納大學(xué)研究團隊發(fā)現黑色素瘤細胞在常氧和缺氧條件下都釋放小細胞外囊泡sEV，但只有缺氧誘導的sEV表達CA-IX mRNA和CA-IX蛋白，據此開(kāi)發(fā)一種ELISA檢測方法，相關(guān)成果于2023年發(fā)表在International Journal Of Molecular Sciences[4]。 缺氧處理HEK293pRTS-CA9 cells獲得sEVs后，為了鑒定其表面是否有CA-IX蛋白，作者使用Biacore分別檢測了anti-CA-IX 抗體與CA-IX蛋白及sEVs的結合，確定了sEVs表面的CA-IX蛋白。
圖5：Biacore檢測anti-CA-IX抗體與CA-IX蛋白及sEVs的結合
外泌體等細胞外囊泡的功能研究，及其在在治療、診斷領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)愈加火熱，持續的技術(shù)和實(shí)驗進(jìn)展將會(huì )揭示更多其異質(zhì)性和生物學(xué)功能的信息，促進(jìn)其用于治療和診斷疾病。Biacore作為高靈敏、高精準的分子互作技術(shù)，可以為各類(lèi)型分子間的相互作用提供高質(zhì)量的結合動(dòng)力學(xué)、親和力、濃度等數據，期待與廣大用戶(hù)共同發(fā)現更多新療法，新應用。
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