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      大數據來(lái)了 微量樣品測量誤差的來(lái)源分析

      在日常的微量核酸與蛋白質(zhì)定量中,大家都會(huì )或多或少的遇到測量不準確的問(wèn)題。這有時(shí)來(lái)源于主觀(guān)的判斷,也可能因為與其他方法的對比。樣品的定量結果與預期值出現一定偏差有時(shí)是正常的事情,可能是因為不同測量方法本身存在的差異,如使用Nano儀器與Qubit的結果對比,即NQ比(具體可參考“每天都提核酸,聽(tīng)說(shuō)過(guò)NQ比嗎?”),或者使用紫外法對比HPLC的結果。而對于單純的使用微量樣品進(jìn)行基于紫外法的定量,如果出現很大的偏差,則可能是由于設備、樣品狀態(tài)和上樣操作等多種因素造成的,應當引起重視。

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          根據Implen對來(lái)自全球的超微量用戶(hù)的長(cháng)期追蹤與統計,我們總結出了可能的四種大概率原因,希望大家在設備使用的過(guò)程中多加注意,輕松的使用超微量設備獲得可靠的結果。

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      光程漂移

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          超微量設備由于光程漂移而產(chǎn)生誤差的可能性占比為35%,是第一大可能因素。設備在使用一段時(shí)間后出現的性能下降,可能是相對普遍的,而對于超微量設備,較大的變數就在于光程系統的準確與漂移。各個(gè)品牌都會(huì )采用精密的光程設計,精確到微米級別,但隨著(zhù)設備的使用,細小的部件磨損或漂移也可能導致光程的偏差,進(jìn)一步表現為測量結果的偏差。且這種偏差將會(huì )被放大,這是由于設備的光程虛擬稀釋倍數造成的 – 吸光值測量結果需要乘以光程倍數,而同時(shí)誤差也將被放大同樣的倍數。

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          不同的設備可能有不同的光程切換設計,一些結構在切換的過(guò)程中將會(huì )產(chǎn)生機械切割,需要通過(guò)維護和光程校準,修復偏差,可參考廠(chǎng)家的說(shuō)明書(shū)或維護指南。Implen所采用的真實(shí)光程技術(shù):即錨定光程切換技術(shù),采用電磁彈片的切換方式,在兩個(gè)精確定義的光程間切換,無(wú)中間位置,可確保光程的準確性,而無(wú)需進(jìn)行維護和光程校準。


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      混勻問(wèn)題&濁度

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          樣品的均質(zhì)性是濃度測量的前提,由于混勻或濁度的問(wèn)題導致的測量誤差,可能性占比達30%。以正確的方式混勻樣品,是測量前的必要步驟,可通過(guò)渦旋、離心、震蕩、彈撥樣品管等多種方式實(shí)現。一些特殊樣品,槍頭取樣的位置不同也可能導致測量結果不同,如易產(chǎn)生濃度梯度或易沉降的樣品。一些樣品中具有一定的濁度,雖然可通過(guò)背景校正進(jìn)行修正,但仍不能排除由此導致的測量誤差,濃度測值通常會(huì )偏高,需要進(jìn)行具體評估。在嚴格的場(chǎng)合下,可通過(guò)雙波長(cháng)或多元散射校正的方式進(jìn)行修正。NanoPhotometer?具有濁度警告功能,可提示用戶(hù)較差的樣品質(zhì)量和潛在問(wèn)題。

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      樣品&上樣問(wèn)題

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          有時(shí)樣品本身是存在問(wèn)題的,和上樣問(wèn)題一起達到了20%的誤差可能性占比。如一些溶解在高鹽緩沖液或在待測波長(cháng)處具有吸收的緩沖液中的樣品。在空白測量的時(shí)候,實(shí)際上引入了空白基線(xiàn)的不確定度,樣品測值時(shí)可能會(huì )不穩定,甚至會(huì )出現負數。因此,樣品成分要具備方法學(xué)適用性。如果確實(shí)存在一些具有共同吸收的成分,則需要具體評估結果的可靠性,或降低置信預期。

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          一些錯誤的操作習慣,尤其是上樣手法,將影響測量結果。如習慣使用槍頭涂抹樣品,這將導致樣品過(guò)于平鋪在樣品臺上,實(shí)際用于檢測的樣品量可能減少,無(wú)法形成液柱,或不滿(mǎn)足實(shí)際樣品體積。一些容易有氣泡的樣品,如溶解在甘油中的蛋白質(zhì)樣品,移液時(shí)應避免吸入氣泡。黏度較高的樣品可利用反向移液,避免吹出氣泡。

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      樣品蒸發(fā)

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          在一些場(chǎng)景下,樣品蒸發(fā)的問(wèn)題將產(chǎn)生可觀(guān)的偏差。如設備放置在空調出風(fēng)口,樣品液柱不可避免的產(chǎn)生蒸發(fā),將得到偏高的檢測結果(但純度比值通常不會(huì )改變)。一些設備如需在層流或生物安全柜中使用,將影響更大。因此,設備的放置位置需要遵循廠(chǎng)家的手冊,避免這些外部因素影響(包括震動(dòng))。采用樣品壓縮法的Implen產(chǎn)品,采用封閉的檢測環(huán)境,可避免測量過(guò)程中蒸發(fā)的影響,更可適用于微量樣品動(dòng)力學(xué)分析等應用。對于一些含有有機溶劑成分的樣品,蒸發(fā)的影響更加可觀(guān),一些因素共同作用,可能導致很大的偏差。

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          以上四類(lèi)原因是導致微量分光光度計產(chǎn)生測量誤差的常見(jiàn)可能因素,有時(shí)候可能是多種因素共同作用導致測量偏差較大,充分了解設備的原理、操作方法和樣品狀況,有助于獲得更加可靠的數據。找出原因,對癥下藥,優(yōu)化實(shí)驗過(guò)程,更加輕松、省心的進(jìn)行測量。關(guān)于超微量的任何問(wèn)題,您都可以咨詢(xún)德國IMPLEN。


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