01

OD600的應用--幫助了解細菌的生長(cháng)狀態(tài)

OD600是指在600nm波長(cháng)處的吸光值，常常被用于分析細菌生長(cháng)和進(jìn)行抗生素敏感性測試，在細菌檢測中，測量波長(cháng)需要選擇在生物材料吸光度最小的范圍內。因此，這些細菌生長(cháng)曲線(xiàn)測量通常使用600-670nm左右的紅色波長(cháng)。在細菌連續培養過(guò)程中，在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測菌液的OD600值，然后以時(shí)間為橫坐標，OD600為縱坐標，描繪細菌的生長(cháng)曲線(xiàn)。結合生長(cháng)曲線(xiàn)，可以評估細菌所處的生長(cháng)階段，進(jìn)而可以確定合適的誘導表達或收獲的時(shí)間點(diǎn)。

02

OD600 測量菌液/細胞濃度的原理

細菌密度的測量方式是通過(guò)光的散射，也就是看渾濁程度而不是吸光度，光的散射程度反應的是細胞的生物質(zhì)量而不是細胞個(gè)數，也稱(chēng)濁度測量。濁度法測量非均質(zhì)溶液中是否存在固體顆粒。固體顆?？梢允羌毎?、沉淀、聚集體或溶液中存在的任何其他固體物質(zhì)。顆粒會(huì )散射光束中的光子，因此儀器檢測器會(huì )檢測到較低的光強度。這種現象與吸光度測量截然不同，吸光度測量是指光子被均勻溶液中的特定染料吸收，吸光度和濁度散射的基本區別如圖 1 所示。

圖1：吸光度和濁度散射的基本區別, 在吸光度測定中，由于光被樣品吸收，光電探測器中的光強會(huì )減弱（A）；在濁度測定中，入射光由樣本中的細胞/粒子隨機產(chǎn)生散射。這將導致方向的不確定性。繼續沿直線(xiàn)傳播的光會(huì )進(jìn)入檢測器，光強也會(huì )減弱（B）

03

使用不同的設備測量OD600細菌濃度可能得到不同的數值

對于具有濁度的樣品，如細菌溶液、細胞培養物，測量的“吸光值”是由于光散射，而不是溶質(zhì)分子光吸收的結果。由于光散射的程度受系統光學(xué)特性(比色池和儀器出口狹縫之間的距離、單色器光學(xué)特性、狹縫幾何特性等)的影響，使用不同類(lèi)型的分光光度計測量同一樣品時(shí)，可能會(huì )得到不同的OD600讀數。

那我們來(lái)看下主要有哪些原因影響濁度的測量呢？

一是濁度測量受樣品中顆粒濃度的影響

濁度測量總是在異質(zhì)樣品中進(jìn)行，一般需要測量96/ 384 孔板，現在多數酶標儀通常使用相當窄的測量光束。通常情況下，微孔板光度計的光束直徑不到一毫米，當光束穿過(guò)96孔板的孔時(shí)，測量光束只能覆蓋樣品體積的很小一部分（圖2）。另外，現代微孔板光度計的采樣時(shí)間也很短，通常為毫秒級，這些對于濁度測量來(lái)說(shuō)并不是最佳選擇會(huì )增加變化。比如液體中的固體顆粒并非處于靜止狀態(tài)，而是在整個(gè)液體中自由漂浮。因此，當樣品中只有少量固體顆粒時(shí)，在重復測量中，相同數量的顆粒出現在光束內的概率很低。如果樣品中有100 個(gè)顆粒，那么測量光束區域內的顆粒數最有可能是1個(gè)，但隨機情況下可能是0個(gè)或2個(gè)，甚至3個(gè)。當采樣時(shí)間也以毫秒為單位時(shí)，液體中顆粒的動(dòng)態(tài)流動(dòng)不會(huì )明顯改變單個(gè)測量中的這種情況。因此,當OD值較低時(shí)，檢測精度可能會(huì )明顯降低，吸光度檢測的 CVs% 也會(huì )大于正常值。

同樣，當樣品中的顆粒數量增加到非常多時(shí)，從顆粒上散射的光子會(huì )撞擊到另一個(gè)顆粒并重新散射。這將導致一些散射光子經(jīng)過(guò)多次散射后到達檢測器。因此，濁度測量的線(xiàn)性測量范圍總是低于吸光度測量。

二是不同儀器分光光度計的設計影響濁度測量

吸光度和濁度測量之間第二個(gè)非常重要的區別是，不同儀器的光學(xué)設計會(huì )影響所得到的OD值（圖 3）。因此，不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的微孔板光度計沒(méi)法對同一樣品給出相同的OD值。這里有兩個(gè)影響因素：一是光電探測器收集窗口的大小，二是收集狹縫的大小。探測器窗口越大，收集到的輕微散射光子就越多，因此觀(guān)測到的OD 值就越低。還有一個(gè)主要問(wèn)題是樣品到檢測器的距離。如果檢測器距離樣品很遠，即使是輕微散射光子也會(huì )到達檢測器；如果很近，即使是強烈散射光子也會(huì )被檢測器收集到。因此，這個(gè)距離對得出的OD 值影響也很大。由于每個(gè)制造商的光學(xué)設計不同，這兩個(gè)參數（距離和探測器的大?。┰趦膳_不同的儀器中永遠不會(huì )相同。這些因素不會(huì )影響吸收測定，因為在吸收測定中光束形狀保持不變。檢測器的大小或距離不會(huì )改變到達檢測器的光量。

圖示3：檢測器收集窗口的大小和與樣品的距離都會(huì )改變所測得的OD值，因此不同的儀器會(huì )對相同的樣品給出不同的OD值。檢測到的OD值差異很容易達到20-40%。

比如下圖中，在濁度測定結果的偏差表明，Multiskan Sky 和 SkyHigh 采用了非常相似的光學(xué)設計，因此結果幾乎相同，但Varioskan LUX 和 Multiskan FC 采用了不同類(lèi)型的光學(xué)器件，因此與Sky和SkyHigh有很大不同，兩者之間也存在明顯差異。但在吸光度測量方面，所有四款酶標儀的測量結果完全相同。

圖示4：不同型號酶標儀檢測吸光度和濁度的比較

因此，對于OD600測量，不同酶標儀的結果不能直接進(jìn)行比較。對于OD600測量，使用相同型號的分光光度計可以保障良好的重復結果。而對于不同酶標儀的結果首先需要使用適當的校準曲線(xiàn)進(jìn)行標準化。

常規的酶標儀檢測都具備了光吸收檢測功能，賽默飛多款酶標儀具有單獨模塊用于濁度檢測，比如單功能酶標儀FC，配有比色杯模塊的Multiskan SkyHigh 以及多功能酶標儀Varioskan LUX等，都是核酸、蛋白質(zhì)、菌液濃度及其他物質(zhì)測量的多功能儀器，可為用戶(hù)提供完善的解決方案。